Малотоксичные микросферы для направленной доставки доксорубицина

Рис. 1. Структурная формула доксорубицина

Рис. 2. Световая микроскопия: биополимерные микросферы с инкапсулированным доксорубицином на основе ПОБ

Рис. 3. Биополимерные микросферы с инкапсулированным доксорубицином на основе ПОБ: средний размер микросфер 40,6 ± 10,0 мкм, массовая доля включенного ЛВ 9,7 ± 3,1% (сканирующая электронная микроскопия)

Рис. 4. Кинетика высвобождения доксорубицина из микросфер на основе ПОБ (0,025 М фосфатный буфер рН = 7,4, температура 37 °С): средний размер микросфер 40,6 ± 10,0 мкм, массовая доля включенного ЛВ 9,7 ± 3,1%

Рис. 5. Биодеградация микросфер с инкапсулированным доксорубицином в 0,025 М фосфатном буфере (рН = 7,4, температура 37 °С): средний размер микросфер 40,6 ± 10,0 мкм, массовая доля включенного ЛВ 9,7 ± 3,1% (А – 10 суток, В – 60 суток, С – 120 суток)

Введение

В эпоху развития персонализированной медицины необходимо создавать индивидуальные фармацевтические препараты, учитывающие метаболические особенности конкретного пациента. Для создания лекарственных форм нового поколения важно изучать возможности депонирования лекарственного вещества (ЛВ) в организме и особенности его пролонгированного высвобождения. Сказанное в большей степени касается лекарственных средств химиотерапевтической направленности.

Доксорубицин – противоопухолевый препарат широкого спектра действия. К наиболее опасным побочным эффектам этого препарата, ограничивающим его дозу, относятся кардиотоксичность и миелосупрессия.

Разработанная нами новая технология контролируемого высвобождения препарата может стать основой для создания малотравматичных интраартериальных методик лечения рака печени. Микросферы, содержащие доксорубицин, предполагается вводить в питающую опухоль артерию, где микросферы будут обеспечивать эмболизацию и контролируемую доставку препарата. При этом диаметр вводимых микросфер должен соответствовать диаметру сосуда.

Преимущество микросферной химиоэмболизации перед масляной заключается в том, что микросферы способны удерживать химиопрепарат в опухоли более продолжительный период времени, что повышает эффективность лечения. При этом токсическое воздействие цитостатика на организм уменьшается. Кроме того, появляется возможность изменять концентрацию химиопрепарата в зависимости от вида опухоли.

Таким образом, использование предложенной нами технологии доставки доксорубицина, исключающей его системное воздействие на организм, позволит улучшить качество жизни пациентов.

Доксорубицин – антибиотик антрациклинового ряда, выделенный из культуры Streptomyces peuceticus var. caesius. Молекулярная масса 579,99 Да. Красный кристаллический порошок или пористая масса. Умеренно растворим в воде, нерастворим в спирте. Нестабилен в растворах с рН менее 3 и более 7. На рис. 1 приведена структурная формула доксорубицина. Брутто-формула C₂₇H₂₉NO_11.

Цель

Целью данной работы было получение, а также изучение микросфер на основе ПОБ для направленной доставки доксорубицина. Перед нами стояли задачи получить биополимерные микросферы на основе поли-3-оксибутирата, содержащие доксорубицин, изучить морфологию микросфер с помощью электронной сканирующей и световой микроскопии, а также кинетику высвобождения доксорубицина из микросфер.

Материал и методы

Для получения микросфер из ПОБ с инкапсулированным ЛВ применяли метод одноэтапного эмульгирования [1]. Доксорубицин и ПОБ (молекулярная масса от 220 до 280 кДа) в соотношении 1:4 растворяли в хлороформе (4 мл) и постепенно добавляли к 250 мл 1,2%-ного водного раствора поливинилового спирта (ПВС). Полученный раствор в течение двух часов перемешивали с помощью механической верхнеприводной мешалки RZR 2021 (Heidolph, Германия) при скорости 600–2000 об/мин. После полного испарения органического растворителя более однородные по размеру фракции микросфер фильтровали через текстильные фильтры. Затем микросферы отделяли от ПВС центрифугированием в течение шести минут при скорости 4400 об/мин на центрифуге 5702 R (Eppendorf, Германия). Далее трижды промывали водой для полного удаления эмульгатора и ЛВ на поверхности сфер. После этого микросферы сушили в термостате при температуре 37 °С и полученный порошок растирали в ступке. Процент ЛВ в микросферах определяли спектрофотометрически (по максимумам поглощения – 253 и 290 нм) для доксорубицина при сравнении с контрольным раствором ПОБ и ЛВ в хлороформе. Средний диаметр и стандартное отклонение полученных партий микросфер определяли по микрофотографиям.

Контролируемое высвобождение доксорубицина из микросфер проводили при температуре 37 °С в термостате TC-1/20 (Россия) в 4 мл 0,025 М калий-фосфатного буфера (pH = 7,4) с небольшим добавлением эмульгатора (0,05% Triton X-100 по объему) при перемешивании в пробирках на шейкере со скоростью 300 об/мин. При исследовании кинетики высвобождения доксорубицина через заданные интервалы времени (через один-два часа в течение первых суток, потом через одни-двое суток) микросферы отделяли от буфера центрифугированием на центрифуге 5702 R (Eppendorf, Германия) при скорости 14 000 об/мин и добавляли 4 мл свежего буфера. Содержание ЛВ в опытном растворе определяли спектрофотометрически (контроль 0,025 М калий-фосфатный буфер, рН = 7,2). Остаточное содержание доксорубицина в микросферах оценивали, растворяя их в заданном количестве растворителя, с последующим определением концентрации доксорубицина в растворе спектрофотометрически (253 и 290 нм) и сравнением с контрольными растворами известной концентрации доксорубицина.

Результаты и обсуждение

Были получены микросферы с массовой долей доксорубицина в полимере 9,7 ± 3,1%. Средний диаметр составил 40,6 ± 10,0 мкм. На рисунке 2 отображены микросферы, полученные с помощью световой микроскопии.

Для выявления более полной картины строения микросфер с включением доксорубицина был сделан ряд микрофотографий с помощью сканирующей электронной микроскопии (рис. 3). Как видно, морфология микросфер различна. Одни микросферы имеют мелкоячеистую структуру, другие – более крупную структуру. Иногда при формировании микросфер мелкая микросфера поглощается более крупной. В результате получаются двойные микросферы. Нередко микросферы образуют скопления: на крупных микросферах образуются мелкие, причем более мелкие вписываются в ячейки более крупной.

При изучении высвобождения доксорубицина из микросфер применяли метод контроль-релиза. Профиль высвобождения доксорубицина из микросфер представлен на рис. 4. Высвобождение носило долговременный пролонгированный характер. Это свойство кинетики доксорубицина может быть использовано при разработке малотоксичной длительной химиотерапии. Отсутствие берст-эффекта позволяет избежать влияния первоначального выброса и кардинально снизить токсическое действие на организм. Кроме того, химиотоксичность значительно снижается из-за отсутствия системного воздействия доксорубицина на организм. Это позволит значительно улучшить состояние больного во время лечения и повысить качество его жизни.

Таким образом, полученные результаты служат основанием для разработки малотоксичных химиотерапевтических форм доксорубицина длительного действия.

Согласно данным литературы, в настоящее время активно разрабатываются малотоксичные формы доксорубицина. Уже разработаны термолипосомы с включением доксорубицина [2]. Однако они подвержены очень быстрому разрушению и требуют специальных условий хранения и транспортировки. Микросферы с включением доксорубицина на основе ПОБ лишены этих недостатков.

Как известно, высвобождение ЛВ из биоразлагаемых микросфер предполагает три стадии: первая – взрывной эффект – высвобождение с высокой скоростью, вторая – относительно медленное равномерное высвобождение, третья – быстрое высвобождение, приводящее к полному выходу ЛВ из полимерных микросфер [3].

Известны два основных механизма высвобождения ЛВ из биополимерных систем: диффузия и деградация. Диффузия осуществляется через поры полимера, а также между цепями полимера. Первая стадия высвобождения (взрывной эффект) реализуется за счет диффузионного механизма [3], вторая – за счет двух механизмов, находящихся в равновесии: диффузии и деградации полимера, при которой уменьшается его молекулярная масса и, как следствие, повышается мобильность диффундирующего через полимер ЛВ. Деградация большинства биоразлагаемых полимеров осуществляется за счет гидролиза в объеме полимера и неспецифической ферментативной биодеструкции. На поздних этапах высвобождения деградация играет решающую роль, поскольку высвобождение ЛВ с относительно равномерной скоростью из биополимерной системы происходит благодаря деградации. Третья стадия высвобождения связана с быстрой деградацией полимера, утратившего механическую стабильность, и выходом оставшегося ЛВ [4–6]. Между тем, изучая кинетику высвобождения доксорубицина, мы обнаружили, что первой стадии высвобождения (взрывного эффекта) нет. То есть диффузионный процесс выражен очень слабо. Почему? Возможно, из-за высокой молекулярной массы ЛВ (молекулярная масса доксорубицина 579,99 Да). Практически полное отсутствие берст-эффекта может быть обусловлено также структурной формулой доксорубицина, а именно наличием большой неполярной четырехцикличной группировки. Вероятно, эта группировка за счет сильного гидрофобного взаимодействия с цепями полиоксибутирата тормозит процесс диффузии. Кроме того, гидроксильные группы в составе доксорубицина взаимодействуют с карбонильными и гидроксильными группами полиоксибутирата, образуя сильные водородные связи, что еще больше замедляет процесс диффузии. Высвобождение доксорубицина происходит линейно.

Морфологию деструкции микросфер изучали в процессе длительного высвобождения доксорубицина (120 суток). На рисунке 5 показаны три степени биодеградации микросфер.

На первой стадии наблюдается только начало деструкции. Поверхность сферы постепенно разрыхляется, и от нее отделяются полимерные нити. На второй стадии микросфера распадается на сегменты и полимерная масса выходит в окружающую среду. Третья стадия характеризуется полным распадом структуры полимерной матрицы.

Заключение

Получены малотоксичные микросферы на основе биосовместимого и биоразлагаемого полимера поли-3-оксибутирата с включением доксорубицина. Изучены морфология строения микросфер и кинетика пролонгированного высвобождения доксорубицина. За счет сильных гидрофобных связей между полимерной матрицей и молекулами доксорубицина высвобождение происходит в основном по деструкционному механизму, в то время как диффузионный механизм выражен очень слабо. Берст-эффект (взрывной эффект первоначального выброса) [3] практически не наблюдается. На основе анализа кинетики высвобождения доксорубицина in vitro выявлены принципиальные преимущества полученных пролонгированных лекарственных форм доксорубицина от традиционных лекарственных форм. В отличие от традиционных форм высвобождение доксорубицина из полимерной матрицы не вызывает резкого выброса ЛВ.

Таким образом, кинетический профиль высвобождения ЛВ из микросфер в наших экспериментах позволяет говорить о создании новых малотоксичных микросфер для направленной доставки доксорубицина. В то же время по сравнению с другими биосовместимыми полимерами, такими как полилактиды и полигликолиды, ПОБ характеризуется более высокой гидролитической устойчивостью. Не случайно завершающий этап разрушения биополимерной структуры отсутствует, резкого выброса ЛВ из микросфер не наблюдается [7].

Использование ПОБ позволяет создавать новые малотоксичные микросферы для направленной доставки доксорубицина. По сравнению с традиционной химиотерапией разработанные нами микросферные системы направленной доставки доксорубицина на основе ПОБ помогут снизить местную токсичность и избежать системной токсичности.