Роль клинических, патоморфологических и молекулярно-генетических факторов в выживаемости больных увеальной меланомой

Рис. 1. Клиническая картина увеальной меланомы по данным офтальмоскопии

Таблица. Клинико-морфологические характеристики пациентов, участвовавших в исследовании

Рис. 2. Общая онкологическая выживаемость пациентов

Рис. 3. Ассоциация выживаемости пациентов со статусом хромосомы 3

Рис. 4. Ассоциация выживаемости пациентов со статусом хромосомы 1

Рис. 5. Ассоциация выживаемости пациентов с метилированием промоторного района гена RASSF1A

Рис. 6. Распределение онкологической патологии у родственников пациентов с УМ по нозологическим формам (количество пациентов)

Введение

Увеальная меланома (УМ) – наиболее частая первичная внутри­глазная злокачественная опухоль среди взрослого населения (рис. 1) [1]. Имеют место отдельные случаи развития УМ у детей и подростков [2, 3]. Метастатическая болезнь развивается у половины пациентов с первичной меланомой хориоидеи. Несмотря на наличие современных эффективных методов разрушения и удаления первичной УМ, а также предотвращения ее дальнейшего роста внутри глаза, включающих брахитерапию, протонно-лучевую терапию и энуклеацию, эффективных способов лечения метастатической УМ не существует [4].

Обычно УМ метастазирует в печень (95%), легкие (24%), кости (16%) и кожу (11%), но возможно развитие метастазов и в лимфатических узлах или головном мозге [5].

Прогноз и лечение пациентов с УМ зависят от распространения метастазов опухоли в печень. Медиана выживаемости после выявления метастазов в печень составляет, по разным данным, от четырех до шести месяцев. При этом годичная выживаемость не превышает 10–15% [6, 7]. Пациенты с метастазами других локализаций (легкие, кости) имеют несколько лучшую медиану выживаемости (19–28 месяцев) с годичной выживаемостью 76% [8].

На жизненный прогноз при УМ влияют следующие факторы:

• локализация опухоли в цилиарном теле (ЦТ);
• большие размеры опухоли (высота более 5 мм, диаметр основания более 15 мм);
• наличие экстрабульбарного роста;
• эпителиоидно-клеточный и смешанно-клеточный тип УМ;
• большое число митозов в клетке;
• потеря одной копии хромосомы 3 (моносомия хромосомы 3);
• удвоение хромосомы 8q;
• профиль экспрессии генов класса 2 (GEP 2) [6, 8–12].

Ряд авторов акцентируют внимание на роли молекулярно-генетических факторов, включающих как хромосомные изменения, так и мутации в генах, в определении метастатического потенциала первичной УМ [13, 14]. При анализе молекулярно-генетических маркеров жизненного прогноза при УМ в литературе обсуждается также делеция короткого плеча хромосомы 1, а метилирование гена RASSF1A хромосомы 3 рассматривают применительно к ряду других злокачественных новообразований (немелкоклеточный рак легкого, рак почек). В то же время данные о его значении в онкогенезе УМ противоречивы [9, 15].

Выраженная ассоциация молекулярно-генетического профиля УМ с метастатической болезнью способствует развитию данного вида диагностики. В ряде исследований показано, что большинство пациентов хотят знать риск развития у них метастазов независимо от того, насколько эффективно и доступно лечение [13, 16, 17]. К практической значимости молекулярно-генетических исследований следует отнести возможность проведения адъювантной терапии УМ, поскольку в такие исследования могут быть включены пациенты с высоким риском развития метастазов [13]. С учетом важности определения молекулярно-генетических аберраций для прогнозирования УМ целью данного исследования стал анализ выживаемости группы пациентов с УМ и ее корреляции с такими изменениями, как моносомия хромосомы 3, делеция короткого плеча хромосомы 1 и метилирование гена RASSF1A, а также уточнение клинических, патоморфологических и молекулярно-генетических особенностей метастатической УМ.

Материал и методы исследования

Всего обследовано 104 пациента (66 (63,4%) женщин, 38 (36,6%) мужчин) с УМ, получавших лечение в 2005–2007 гг. Возраст больных составил 22–84 года (средний возраст 53,7 ± 12,2 года). Срок наблюдения – 41–84 месяцев (60,9 ± 8,8 месяца).

У 101 (97,1%) пациента проведена энуклеация, у трех (2,9%) по показаниям – блокэксцизия опухоли. В четырех (3,9%) случаях энуклеации предшествовало органосохранное лечение (курс брахитерапии с применением Ru/Rh-офтальмоаппликаторов). По локализации выделяли меланому цилиохориоидальной зоны – 26 пациентов (25%), хориоидеи – 67 (64,4%), радужки – четыре (3,9%) и иридоцилиохориоидальной зоны – семь (6,7%) пациентов.

После энуклеации пораженного глаза биопсийный материал опухоли и относительно неповрежденной хориоидеи, а также образцы периферической крови (консервант: 0,5 М раствор ЭДТА) сохраняли при температуре -20 ^оС. Для исследования образцов тонкоигольной аспирационной биопсии материал собирали с цитологических препаратов.

Геномную ДНК из образцов опухолей, условно интактной хориоидеи и периферической крови выделяли с помощью протеиназы К с последующей фенол-хлороформной экстракцией. При выделении ДНК из цитологических препаратов собранный со стекла материал обрабатывали лизирующим буфером, содержащим протеиназу К. Полученный лизат использовали в качестве матрицы для постановки полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Потерю гетерозиготности в хромосомных районах 1p36, 1р31.3, 3p25.3, 3p21.3, 3p14.2, 3q12, 3q26.3, 3q28 идентифицировали с использованием высокополиморфных маркеров D1S243, D1S2145, D1S1635, D1S407, D1S3669, D1S438, D3S1038, D3S1317, D3S1568, D3S966, D3S1300, D3S1234, D3S2459, 16xTG_3q26.31, D3S3520, D3S2398. Контролем служила ДНК лейкоцитов периферической крови.

Для определения метилирования СpG-островков промоторных областей генов применяли метод метил-чувствительной ПЦР. В качестве матрицы для ПЦР использовали ДНК из клеток УМ, предварительно гидролизованную рестриктазами HpaII (для гена RASSF1A).

Диспансерное наблюдение осуществляли в соответствии с приказом Минздрава России от 19.04.1999 № 135 один раз в три месяца в течение первого года, затем один раз в шесть месяцев в течение второго года, в дальнейшем – один раз в год во взрослом консультативно-поликлиническом отделении Московского НИИ глазных болезней им. Гельмгольца. Пациенты, которые по разным причинам не могли присутствовать на контрольном осмотре, сообщали о себе по телефону, факсу или через родственников передавали справки от онкологов и офтальмологов с места жительства. Часть данных получена путем запросов в департаменты здравоохранения по месту жительства пациентов.

Статистический анализ проводили с применением точного критерия Фишера. Для исследования выживаемости пациентов после лечения использовали статистический метод множительных оценок Каплана – Мейера, а для оценки различия между двумя выборками – двухвыборочный критерий Вилкоксона (Манна – Уитни) и регрессионную модель Кокса. Для анализа полученной информации все наблюдения разделены на два типа: цензурированные (незавершенные), в которых исход не наступил на момент окончания исследования (пациенты живы) либо пациенты выбыли из исследования (в том числе смерть от других причин), и нецензурированные (завершенные), при которых зафиксирована смерть пациента от метастатической болезни. Расчеты проводили с использованием пакета программ для Windows (Microsoft Excel, Statistica 10.1).

Результаты и их обсуждение

В период с октября 2005 г. по ноябрь 2007 г. в отделе офтальмоонкологии и радиологии Московского НИИ глазных болезней им. Гельмгольца проведена 101 энуклеация и три блокэксцизии УМ с последующим патогистологическим и молекулярно-генетическим изучением во всех исследуемых случаях. Долгосрочное наблюдение пациентов (пять лет и более) проведено во всех случаях. На основе молекулярно-генетического анализа все пациенты были разделены на три группы: первая группа – 45 (43,3%) пациентов с моносомией хромосомы 3, вторая группа – 30 (28,8%) пациентов с делецией короткого плеча хромосомы 1, третья группа – 23 (22,1%) пациента с метилированием гена RASSF1A. Группу сравнения составили 29 пациентов без исследуемых аберраций.

В 11,5% случаев (n = 12) отмечалось наличие как моносомии хромосомы 3, так и делеции короткого плеча хромосомы 1 (1p). В 5,8% случаев (n = 6) выявлены одновременно моносомия хромосомы 3 и метилирование гена RASSF1A. Сочетание делеции короткого плеча хромосомы 1 и метилирования гена RASSF1A установлено у 8,7% (n = 9) исследуемых. Наконец, сочетание трех молекулярно-генетических аберраций выявлено у двух (1,9%) пациентов. У 29 (27,9%) пациентов не зарегистрировано ни одной из исследуемых аберраций.

Для каждой из групп приведены клинические и патоморфологические характеристики (таблица). Статистически значимые (p < 0,05) ассоциации удалось выявить при сопоставлении пациентов из группы моносомии хромосомы 3 и гистологических типов опухоли, причем для данной группы характерно преобладание прогностически наименее благоприятных типов – смешанно-клеточного и эпителиоидно-клеточного (77,8%). Анализ ассоциаций гистологических типов УМ с опухолями из групп 1p и RASSF1A не выявил существенных отличий между различными типами УМ. Кроме того, в группе моносомии хромосомы 3 зафиксирована ассоциация с вовлечением цилиарного тела в опухолевый процесс, что расценено как неблагоприятный фактор, ухудшающий жизненный прогноз [12]. Так, в данной группе 51,1% пациентов были с цилиохориоидальной и иридоцилиохориоидальной локализацией УМ, что представляется значимым по сравнению с группами 1p, RASSF1A, а также общей когортой пациентов, в которой преобладали новообразования хориоидальной локализации без вовлечения цилиарного тела (p = 0,038). В группе пациентов с делецией короткого плеча хромосомы 1 выявлена значимая ассоциация с экстрабульбарным ростом опухоли, одним из наиболее неблагоприятных прогностических факторов, увеличивающих вероятность развития метастатической болезни [11]. По нашим данным, выживаемость в группе делеции короткого плеча хромосомы 1 не отличалась от общей выживаемости, в связи с чем данная ассоциация может носить случайный характер.

Смертность от метастатической болезни составила 30,8% (n = 32) (рис. 2). Живые на момент исследования (n = 65; 62,5%) и умершие по другим причинам (n = 7; 6,7%) составили 69,2% от общего количества пациентов в исследуемой группе.

Средний срок наблюдения в общей группе пациентов составил 60,1 ± 9,3 месяца, при этом средняя продолжительность жизни пациентов от ликвидационного хирургического лечения до гибели вследствие метастатической болезни – 62,9 ± 10,1 месяца. Следует отметить, что в исследование вошли пациенты с большими УМ (средняя высота опухоли – 9,3 ± 2,7 мм, диаметр основания – 15,7 ± 3,6 мм). Таким образом, наши данные об общей выживаемости согласуются с данными других авторов, изучавших этот вопрос [7].

Отдельный интерес представляло изучение кумулятивной доли выживших в группе с моносомией хромосомы 3 (n = 47) и группе сравнения (n = 57) (рис. 3). Анализ полученных данных показал, что в группе моносомии хромосомы 3 смертность от метастатической болезни превысила выживаемость (53,2 против 46,8%; p = 0,002), что свидетельствовало о значимой роли моносомии хромосомы 3 в выживаемости пациентов с УМ. Аналогичные данные приводят зарубежные авторы [10, 16]. В группе сравнения выживаемость составила 87,7%, смертность – 12,3%, что более чем в четыре раза ниже по сравнению с группой моносомии хромосомы 3. Таким образом, нами подтверждена ассоциация моносомии хромосомы 3 со сниженной выживаемостью при УМ.

При анализе выживаемости в группе с делецией короткого плеча хромосомы 1 (n = 30) и группе сравнения (n = 74) смертность в группе 1p составила 36,7%, а в группе сравнения – 28,4% (рис. 4). Различия в выживаемости статистически незначимы (p = 0,064). Схожие данные получены при сопоставлении пациентов из группы с метилированием гена RASSF1A (n = 23) и пациентов группы сравнения (n = 81) (смертность 26,1 и 32,1% соответственно) (рис. 5). Однако следует отметить, что в отличие от группы с делецией короткого плеча хромосомы 1 данные различия статистически достоверны (p = 0,037 по регрессионной модели Кокса), что может свидетельствовать о более благоприятном характере течения опухолевого процесса в новообразованиях с метилированием гена RASSF1A.

В группе пациентов с сочетанием моносомии хромосомы 3 и делецией короткого плеча хромосомы 1 (n = 12) смертность составила 75%, что значительно превысило общую онкологическую смертность (p = 0,001). При сочетании моносомии хромосомы 3 и метилирования гена RASSF1A (n = 6) мы выявляли смертность в 2/3 случаев (67%) (p = 0,03), а при сочетании делеции короткого плеча хромосомы 1 и метилирования гена RASSF1A в девяти случаях (22,2%) (p = 0,068). Из двух пациентов, имевших все три молекулярно-генетические аберрации, один умер от метастатической болезни через 51 месяц после проведенного лечения.

Таким образом, делеция короткого плеча хромосомы 1 не оказывала существенного влияния на выживаемость пациентов с УМ, а метилирование гена RASSF1A ассоциировано с благоприятным жизненным прогнозом. Сочетание нескольких молекулярно-генетических изменений значимо ухудшало выживаемость пациентов.

Дополнительно проведено разделение пациентов на группы в зависимости от наличия (первая группа – 32 (30,8%) пациента) или отсутствия (вторая группа – 72 (69,2%) пациента) метастатической болезни. Статистически значимые различия между группами выявлены в распределении патогистологических типов опухоли. Так, в первой группе количество веретеноклеточных типов УМ, характеризующихся, согласно данным литературы [9], наиболее благоприятным течением опухолевого процесса, составило 34,3%, что на 12,9% меньше, чем во второй группе (р < 0,05). В то же время количество пациентов с неблагоприятными типами УМ (смешанно-клеточным и эпителиоидно-клеточным) составило около 2/3 (65,7%) общего количества пациентов первой группы. При этом доля эпителиоидно-клеточных УМ в обеих группах отличалась незначительно – 21,9 и 20,8% соответственно. Таким образом, наряду с подтверждением благоприятного в отношении жизненного прогноза веретеноклеточного и неблагоприятного смешанно-клеточного типа УМ не выявлено существенных отличий в частоте эпителиоидно-клеточного типа опухоли, относимого ранее к неблагоприятным [9].

В первой группе доля УМ с вовлечением в опухолевый процесс цилиарного тела (цилиохориоидальной и иридоцилиохориоидальной локализации) была достоверно выше, чем во второй (43,8 против 30,6%; р < 0,05). Данный признак, как показано в ряде исследований, относится к наиболее неблагоприятным в отношении жизненного прогноза [12].

При сопоставлении двух групп по таким клиническим признакам, как наличие пигментации, гемофтальма, вторичной отслойки сетчатки, субретинального экссудата и собственных сосудов опухоли, статистически значимые различия не выявлены. Необходимо отметить, что разница между первой и второй группой по наличию вторичной отслойки сетчатки составила 17,4% (56,2 и 73,6% соответственно). Но данное различие скорее всего носит случайный характер.

Отдельный интерес представляет ассоциация с развитием метастатической болезни такого неблагоприятного фактора, как экстрабульбарный рост опухоли. Подавляющее большинство авторов рассматривают его как фактор, значительно ухудшающий жизненный прогноз [9, 11]. Согласно нашим данным, процент УМ с наличием экстрабульбарного роста в первой группе был несколько выше, чем во второй (12,5 и 9,7% соответственно), но данные отличия статистически незначимы (p = 0,065). Размер экстрабульбарных узлов в группах различался. Так, в первой группе в трех из четырех случаев обнаружены большие узлы до 7 × 4 мм и лишь в одном случае – единичные опухолевые клетки. Во второй группе, напротив, в пяти из семи случаев наблюдались единичные узелки без значительного прорастания, а в двух случаях – небольшие очаги до 2 × 2 мм. Подобные различия могут свидетельствовать о роли размера экстрабульбарного узла в жизненном прогнозе при УМ.

При сборе анамнеза у пациентов при обращении в клинику института учитывался такой фактор, как наличие онкологических заболеваний у ближайших родственников. Как правило, пациенты могли рассказать о заболеваниях родственников во втором или третьем поколении (родители, родные бабушки и дедушки), крайне редко в четвертом (прабабушки и прадедушки), а также родственников второго и третьего колена (дяди, тети, двоюродные и троюродные братья/сестры и т.д.). Всего отягощенный семейный анамнез по онкопатологии установлен у 19 больных. Основные виды злокачественных новообразований у родственников пациентов с УМ представлены на рис. 6.

Анализ показал, что отягощенный семейный онкологический анамнез в первой группе составил 31,2%, во второй – 12,5% (p = 0,002). Такие достоверные различия могут свидетельствовать о значимости семейного фактора в развитии метастатической болезни при УМ, однако в литературе данный фактор остается несколько недооцененным.

Наибольшие различия между двумя группами получены при анализе статуса хромосомы 3. Так, процент УМ с моносомией хромосомы 3 в первой группе превысил таковой во второй группе практически в три раза (78,1 против 27,8%; p = 0,0001). Подтверждена исключительная значимость статуса хромосомы 3 для жизненного  прогноза при УМ, что согласуется с данными литературы [7, 9, 13, 15].

Несмотря на некоторое преобладание УМ с делецией короткого плеча хромосомы 1 в первой группе (34,3 против 26,4%), отличия статистически незначимы (p > 0,05). Вместе с тем процент УМ с метилированием гена RASSF1A в группах достоверно различался – 18,8 и 23,6% соответственно (p = 0,04), что свидетельствовало о протективной роли данного фактора в развитии метастазов УМ.

Отсутствие какого-либо из исследуемых молекулярно-генетических изменений выделено как отдельный прогностический фактор. В первой группе доля пациентов с отсутствием исследуемых молекулярно-генетических изменений составила 12,5%, во второй – 34,7% (p = 0,035). Однако значение данного фактора для жизненного прогноза при УМ представляется относительным, поскольку исследование проводили по ограниченному количеству молекулярно-генетических маркеров.

Заключение

В работе показана статистически значимая ассоциация моносомии хромосомы 3 со смешанно-клеточным и эпителиоидно-клеточным типом УМ, вовлеченностью в процесс цилиарного тела, а также ассоциация делеции короткого плеча хромосомы 1 с наличием экстрабульбарного роста опухоли. Изучены общая пятилетняя выживаемость пациентов и смертность в результате метастатической болезни в группе больших УМ. Показана достоверная ассоциация моносомии хромосомы 3 со сниженной выживаемостью пациентов, а метилирования гена RASSF1A – с улучшением жизненного прогноза.

Все пациенты с УМ должны быть обследованы на моносомию хромосомы 3. При ее выявлении рекомендуется проведение регулярного обследования отдаленных органов (печень, легкие) методами УЗИ, КТ, ПЭТ-КТ для определения возможных метастатических очагов.